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普瑞邦饲料中伏马毒素HPLC检测的解决方案

发布时间: 2019-03-29  点击次数: 430次

伏马毒素起因和特性

伏马毒素主要是由串珠镰刀菌菌f.moniliforme和f.proliferatum在一定温度和湿度条件下繁殖所产生的次级代谢产物。直到1988年,南非和美国的研究人员才从霉变的玉米中分离出伏马毒素(fumonisins)b1。到目前为止,发现的伏马菌素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FP1共11种。粮食在加工、贮存、运输过程中易受上述两种真菌污染,特别是当温度适宜时,更利于其生长繁殖,从而产生出一类结构性质相似的毒素,其中FB1是其主要组分占60%以上,其毒性也大。因此,伏马毒素可以通过粮食加工、饲料生产等过程对畜牧业乃至人类健康产生较严重的危害。

伏马毒素纯品为白色针状结晶,为一类相关的极性、水溶性代谢产物,为多氢醇和丙三羧酸的双酯化合物,对热很稳定,不易被蒸煮破坏,在多数粮食加工处理过程均比较稳定。

食品污染状况

FB1对食品污染的情况在世界范围内普遍存在,主要污染玉米及玉米制品,其污染的饲料主要为以玉米为原料的饲料。FB1为水溶性霉菌毒素,对热稳定,不易被蒸煮破坏,所以同AFT(黄曲霉毒素)一样,控制农作物在生长、收获和储存过程中的霉菌污染仍然是至关重要。

伏马菌素对玉米的污染率和污染水平受国家和地区、玉米品种、季节的影响。1995年~1996年,Amra等对从埃及不同省份收集的120份样品进行了检测,结果显示,冬季收集的白玉米和黄玉米FB1污染率均为高。伏马菌素还可以污染其他粮食及其制品,且不同地区污染状况也存在差异。

1996年我国对玉米、小麦等粮食作物中FB1污染进行调查。发现不同地区均有不同程度污染。我国食道癌高发区林县的玉米伏马菌素污染率为48%。因此,人们怀疑该地区食道癌高发与食用污染此毒素玉米相关。该毒素已被世界卫生组织列为近年来首先进行研究的几种霉菌毒素之一。

伏马毒素的危害

1.马大脑白质软化症              
  这是一种马的神经失调疾病。根据1988年南非研究人员的试验结果,每天以0.125mgkg体重的水平给马进行皮下注射,大约7天后马开始发疯、发狂,冲撞栏杆而死。解剖发现马的大脑呈现白质软化症状。1989年,玉米中的伏马毒素给美国有很多州的农业和畜牧业造成了巨大的损失。               
  2.猪肺水肿             
  1992年和1994年美国和南非的科学家研究表明,每天伏马毒素的摄取量在0.4mgkg体重以上均可引发猪的肺水肿,还可造成猪生殖系统的紊乱,如早产、流产、死胎和发情周期异常等。这种病在美国及其他国家都有发现。
  3.小鼠肝癌              
  1991年南非科研人员对小鼠进行了伏马毒素的毒理试验,试验结果表明伏马毒素引发肝癌。1998年又对大鼠进行了伏马毒素毒理试验,获得相同的结果。                
  4.人类食道癌              
  早在1988年南非科学家就对食道癌发病率高和低的地区进行过调查,食道癌发病率与主食玉米受伏马毒素污染呈正相关,进一步的动物试验也得到了相同的结果。1994年中国学者和日本学者对食道癌高发区的河南省林县进行了一次调查,发现该地区主食玉米中伏马毒素水平高达30~50mgkg,发霉玉米中伏马毒素高值达118.4mgkg。目前伏马毒素引发食道癌的机理还不清楚,需进一步确证和研究。 

各国对伏马毒素的*

2001年美国食品与药物管理局(FDA)发布了供人类食用的玉米和玉米产品伏马毒素高*指导性公告,规定人类食用玉米中伏马毒素高*为2mgkg;同时,FDA的畜牧医学中心(CVM)也发布了动物饲料中伏马毒素的高*指导性公告,规定其*范围为1~50mgkg


              表2  FDA对伏马毒素在动物饲料中的推荐*(20006月)

 

 玉米及其副产品用于下列动物饲料

 推荐*(FB1+FB2+FB3,mg/kg

 马和兔

 5ppm(不超过日食量的20%)*

 猪和鲶鱼

 20ppm(不超过日食量的20%)*

 产子的反刍动物、家禽、貂

 30ppm(不超过日食量的20%)*

 大于3月用于屠宰的反刍动物、用于制作裘皮的貂

 60ppm(不超过日食量的20%)*

 用于屠宰的家禽

 100ppm(不超过日食量的20%)*

 其他各种牲口和宠物

 10ppm(不超过日食量的20%)*

 *以干基作为计算基准

伏马毒素的检测

伏马毒素的检测先后使用过薄层色谱法、气相色谱法、酶联免疫法(ELISA)、液相色谱法(HPLC)等,目前研究和应用得多的是利用免疫亲和柱净化后的荧光仪检测法和HPLC法。

普瑞邦伏马毒素检测方案介绍

(一)   免疫亲和柱-液相色谱法:符合GBT 25228-2010 粮油检验 玉米及其制品中伏马毒素含量测定 免疫亲和柱净化液相色谱法

Pribolab®(普瑞邦)应用免疫亲和柱净化,利用液相色谱仪和荧光检测器检测可提供伏马毒素测定的HPLC检测方案,得出的结果准确可靠,检出限好,是一种很好的检测伏马毒素的方法,仅供广大用户参考。

1.   设备和耗材配置  

 

序号

品名

规格及参数

数量

用途

1

液相色谱仪

 

一台

分析检测

2

荧光检测器

 

一台

读取荧光信号

3

Pribolab真菌毒素色谱柱

150/250mm

货号:PRC-18

一支

配套各类色谱仪,霉菌毒素检测用

4

PriboFast®伏马毒素免疫亲和柱

3ml25/盒,

货号:IAC-050-3

若干

高特异性,纯化样本

5

高速均质器

达到22000rpm 以上,货号:EQ-WR-1L

一台

耐腐蚀,高速,均质

6

PriboFast®玻璃纤维滤纸

100P,110mm1.5μm

货号:GMF-110

一盒

霉菌毒素过滤

7

PriboFast®八位泵流操作架

货号:EQ-PUMP-8

一台

用于控制免疫亲和柱过柱流速

8

伏马毒素标准品

50µg/ml伏马毒素B1, 50µg/ml伏马毒素B2溶于乙腈/水(50/50),

货号:STD#2011

1ml

用于定量分析标准品的配制

2. 样品前处理:普瑞邦为饲料提供不同的处理方案(详细方案请联系普瑞邦,普瑞邦开发了针对多种饲料基质提供优化的处理方案)

样品处理:

花生,玉米,大米,小麦及其制品和饲料

----50 g 研磨的样品 + 5g盐置于均质杯中。

----加入100mL 甲醇:水(8020)溶液。

----盖上杯盖,高速均质5分钟。

----4000r/min离心5min或用槽纹滤纸过滤;

----取10mL滤液并加入40mL PBS溶液将滤液稀释,混匀。玻璃微纤维滤纸过滤,取稀释后液体待测;

----将上步稀释液通过微纤维滤纸过滤,滤液收集于玻璃注射器筒中,量取10mL

3. 免疫亲和柱净化:

操作程序:符合GB/T 25228-2010国标方法

----将免疫亲和柱连接于泵流操作架的10mL注射器下。准确移取10mL样品提取液注入注射器;

----富集:空气压力泵与注射器连接,调节压力使提取液以约2-3mL/min(1滴/3秒)流速缓慢通过免疫亲和柱,直至2-3mL空气通过柱体;

----洗涤: 用10mL 0.1%的吐温/PBS清洗,再以10mL水淋洗柱子2次,弃去全部流出液,并使2-3mL空气通过柱体;

----洗脱可采取以下方式之一进行优选2

----洗脱1: 准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱,孵育30秒以上(孵育即甲醇在柱子中浸泡),然后以流速为1-2mL/min过柱,收集全部洗脱液供检测用。

----洗脱2: 为保证洗脱充分,建议以1.5mL色谱甲醇分两步进行洗脱,流速为1-2mL/min(1滴/秒,重力即可) 。首先,加入0.5ml甲醇洗脱,重力过柱,当溶剂通过柱子后,等待30秒后再加入1ml甲醇进行洗脱,过柱前孵育30秒以上(孵育即甲醇在柱子中浸泡)。收集全部甲醇洗脱液供衍生化反应用。

4. 衍生化反应

分别取净化后的样本液和标准工作溶液各50ul,分别置于1ml的各个试管中,各加入50ul OPA衍生液,涡流混合器上混合30s,静置3min后,立即取20ul衍生液进液相色谱仪分析。

5. 液相色谱分析

HPLC-色谱柱 :C-18色谱柱   150 x 4.6 mm;
流  动  相 :甲醇-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液  77:23
流  速  : 1 mL/min                         
柱  温  : 室温
进 样 体 积 : 20μL
荧光检测器:λ-激发波长:335nm λ-发射波长:440 nm
HPLC配置:液相色谱仪带有荧光检测器

温馨TIPS

1. 谷物、饲料中真菌生长繁殖的有利条件主要是适宜的温度与水分。如能将谷物、饲料等贮存于10℃以下,水分保持在10%以下,就能有效地防霉。

2. 从事真菌毒素科研及检测的人员,必须注意防护,如穿戴隔离衣帽,在进行真菌分离培养工作时,应戴口罩,并尽量防止孢子飞扬

3. 操作台面如有漏溅,应立即用新配的5%次氯酸钠消毒以5%次氯酸钠(NaOCl)处理时,黄曲霉毒素于数秒钟内即被破坏,故是常用的消毒剂。

4. 也有应用生物学方法解毒的报道,生物学方法成本低,收效大,可能是一种有前途的除毒措施。

鉴于霉菌毒素对人体的危害,提醒各位奋斗在抗毒一线的老师们一定要注意保护自身安全哦! 

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