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15版药典中药黄曲霉毒素检测 免疫亲和柱---光化学柱后衍生法

发布时间: 2019-03-29  点击次数: 406次

本法系用液相色谱法(通则0512)测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计),除另有规定外,按下列方法测定。

色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂

流动相:甲醇-乙腈-水(40:18:42)

光化学柱后衍生器(254nm. PriboFast-KRC光化学柱后衍生器.Pribolab-MDU光化学柱后衍生器)

荧光检测器检测,激发波长:360nm(365nm)   发射波长:450nm

两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

混合对照品溶液的制备

精密量取PriboFast®STD#1082AFT黄曲霉毒素混合对照品溶液(黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0µg/mL、 0.3µg/ mL、1.0µg/ mL、0.3µg/ mL)0.5 mL,置10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,作为储备溶液。精密量取储备溶液1 mL,置25 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,即得。

供试品溶液的制备

1.取供试品粉末约15g(过二号筛),精密称定,加入氯化钠3g,置于均质瓶中,精密加入70%甲醇溶液75mL,高速搅拌2分钟(搅拌速度大于11,000转/分,普瑞邦均质器Pribolab® WR800转速22,000 r/min)

2.2500r/min离心5分钟或用槽纹滤纸过滤。

3.精密量取上清液15mL,置50mL量瓶中,用PBS溶液稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm,PriboFast®玻璃微纤维滤纸代替更好,性能较高,效率高)过滤。

4.准确移取20.0mL样品提取液,过PriboFast® 免疫亲和柱,过柱时流速不能快,流速快的话回收效率差,建议采取重力过柱。

5.用PBS溶液20mL洗涤,洗涤液弃去。

6.为保证洗脱充分,建议以2.0mL色谱甲醇分三步进行洗脱,重力洗脱即可。首先,加入1.0mL甲醇洗脱,当溶剂通过柱子后,孵育30s(孵育即甲醇在柱子中浸泡);然后,再加入0.5mL甲醇进行洗脱,过柱前孵育30s;后,再加入0.5mL甲醇洗脱,过柱前孵育30s,并使2-3mL空气通过柱体,收集洗脱液,置2mL量瓶中,并用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。 (免疫亲和柱操作建议使用PriboFast®泵流操作架,便于控制各个步骤流速,保证较好的回收率)

液相色谱条件(光化学柱后衍生法)

流动相:甲醇-乙腈-水(40:18:42)

柱  温:30 ℃

进样量:20 μL

激发波长:360 nm;发射波长:450 nm

PriboFast®KRC光化学柱后衍生器(254nm)

流速:  0.8 mL/min    

保留时间:G2: 10 min, G1:12 min, B2:14 min, B1:18min(大约)

PriboFast®MDU光化学柱后衍生器(254nm)

流速:    1.2 mL/min    

保留时间:G2: 3 min, G1:5 min, B2:6 min, B1:9 min(大约)

测定法: 分别精密吸取上述混合对照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL,注入液相色谱仪,测定峰面积,以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标,绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液20~25μL,注入液相色谱仪,测定峰面积,从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量,计算,即得。

【附注】

(1)本实验应有相应的安全、防护措施,并不得污染环境。

(2)残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿,应置于贮存容器(装有10%次氯酸钠溶液)内,浸泡24小时以上,再用清水将玻璃器皿冲洗干净。

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