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94份玉米中6类真菌毒素检测及污染情况分析

发布时间: 2022-06-06  点击次数: 343次

摘要:建立了玉米的一步法提取6类真菌毒素同时检测的分析方法,共分析了96份玉米中6类真菌毒素的污染情况及地域分布情况,为监测饲料质量提供技术指导。称取的样品添加6类真菌毒素同位素内标,以84%乙腈水和50%甲醇水作为提取试剂,以2mM乙酸铵0.1%甲酸水溶液和甲醇/乙腈和水为流动相梯度洗脱,采用液相色谱-串联质谱进行检测。94份玉米中6类真菌毒素的检出率为98%,单种毒素检出率最高的是伏马毒素B1和B2,高达88%,呕吐毒素和OTA检出率极低,均未检出。伏马毒素B1和B2、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的最高残留量分别是89.1mg/kg、76.4ug/kg、3.95×103mg/kg和7.0mg/kg。地域分布上具有分布范围广,污染较严重的特点。建立的6类真菌毒素检测方法操作简单、结果准确,结果分析对玉米中真菌毒素污染检测和防控具有重要意义。

关键词:真菌毒素、液相色谱--串联质谱、污染情况、真菌毒素同位素内标

真菌毒素属于真菌的代谢产物,几乎可以污染所有的农作物,会损害动物体的肝脏、肾脏及皮肤组织等,进而通过食物链的形式影响到人体的健康。[1]已知的真菌毒素多达300种以上,目前多个国家均建立了饲料中真菌毒素的*,[2-3]我国已于2017年推出国家强制性标准GB 13078-2017饲料卫生标准,并于2018年实施,其对黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、OTA、伏马毒素B1和B2、T-2毒素等做出明确的检测方法规定和*。本文采用94份玉米为样本,对这6类真菌毒素进行检测方法开发和污染情况分析。为多毒素的快速检测提供技术支持的同时,也为饲料中真菌毒素污染的监测和防控提供帮助。本文采用液相色谱-串联质谱,通过加入同位素内标进行校正的手段,开发6类真菌毒素的检测方法,并对94份玉米样品进行6类真菌毒素的检测及污染情况分析。

1 材料

1.1仪器 TSQ Quantis液相色谱-串联质谱、KS-7200DE超声波提取仪和TGL-16M高速冷冻离心机

1.2试剂 真菌毒素标准品:黄曲霉毒素B1(货号:STD#1052)、呕吐毒素(货号:STD#3102)、玉米赤霉烯酮(货号:STD#4012)、OTA(货号:STD#5012)、伏马毒素B1和B2(货号:STD#2013)和T-2毒素(货号:STD#3111)

真菌毒素同位素内标:黄曲霉毒素B1同位素内标(货号:STD#1041U)、呕吐毒素同位素内标(货号:STD#3101U)、玉米赤霉烯酮同位素内标(货号:STD#4010U)、OTA同位素内标(货号:STD#5010U)、伏马毒素B1同位素内标(货号:STD#2030U)、伏马毒素B2同位素内标(货号:STD#2040U)和T-2毒素同位素内标(货号:STD#3110U)

1.3样品  96份玉米种类及地域分布(样品来源于全国近30个省份及地区)

96份玉米种类涉及青农1801、郑单958、万盛189、登海W189、洛玉16、中选777等。依据我国区域划分方式将94份玉米的分布区域进行汇总统计

区域

省份

份数

华东地区

山东、江苏、安徽、浙江、福建、上海


22

华南地区

广东、广西、海南

10

华中地区

湖南、湖北、河南、江西

12

华北地区

北京、天津、河北、山西、内蒙古

17

西南地区

四川、云南、西藏、重庆

12

西北地区

宁夏、新疆、青海、陕西、甘肃

10

东北地区

黑龙江、吉林、辽宁

11







2 方法

2.1色谱及质谱条件:

色谱柱: Hypersil GOLD C18 (100*2.1 3um)

流动相: 2mM乙酸铵0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脱伏马毒素B1和B2、黄曲霉毒素B1、OTA和T-2毒素/乙腈水梯度洗脱呕吐毒素和玉米赤霉烯酮

梯度表1

时间

流速mL/min

2mM乙酸铵0.1%甲酸水

甲醇

0

0.3

70

30

1

0.3

70

30

3.5

0.3

30

70

4

0.3

30

70

5

0.3

5

95

9

0.3

5

95

10

0.3

70

30






梯度表2

时间

流速mL/min

乙腈

0

0.3

70

30

1

0.3

70

30

3.5

0.3

30

70

4

0.3

30

70

5

0.3

5

95

9

0.3

5

95

10

0.3

30

70






采用ESI离子源,分别用正离子模式扫描和负离子模式扫描,多反应监测模式(MRM)采集数据,6类真菌毒素及其对应同位素内标的质谱参数见下表:

6类真菌毒素及其对应同位素内标的质谱参数

毒素名称

母离子m/z

子离子m/z

碰撞电压/V

射频透镜

电压/V

采集模式

FB1

722.3

334/352

40/36

279

[M+H]+

13C-FB1

756

356/373/374/737

39/34/35/26

180

[M+H]+

FB2

706.35

318/336

35/39

243

[M+H]+

13C-FB2

740.7

340/358/376/723

40/38/34/28

216

[M+H]+

AFB1

313.1

241/269/285

38/32/23

176

[M+H]+

13C-AFB1

330

255/284/301

39.7/32.8/24.1

181

[M+H]+

OTA

404.088

193/221/239/241/358

43/37/24/20/15

143

[M+H]+

13C-OTA

424

250/377

27/14

140

[M+H]+

T-2

484.21

185/215/305

22/19/13

109

[M+NH4]+









毒素名称

母离子m/z

子离子m/z

碰撞电压/V

射频透镜电压/V

采集模式

13C-T-2

508.4

198/229/322

22/19/14

121

[M+NH4]+

DON

295

138/265

17/12

109

[M-H]-

13C-DON

310

145/279

14/12

109

[M-H]-

ZON

317

131/175/273

30/24/19

170

[M-H]-

13C-ZON

335

140/185/290

31/25/19

178

[M-H]-





注:FB1为伏马毒素B1简写(下同),FB2为伏马毒素B2简写,AFB1为黄曲霉毒素B1简写,OTA为赭曲霉A简写,T-2位T-2毒素简写,DON为呕吐毒素简写,ZON为玉米赤霉烯酮简写;13C为其相应的同位素内标简写

2.2标准品的配制

2.2.1混合标准品配制:配制伏马毒素B1和B2浓度为2.4ppm、黄曲霉毒素B1浓度为80ppb、玉米赤霉烯酮1.6ppm、呕吐毒素3.2ppm、T-2毒素1.6ppm、OTA160ppb的混标

2.2.2同位素内标配制:配制伏马毒素B1和B2浓度为240ppb、黄曲霉毒素B1浓度为8ppb、玉米赤霉烯酮160ppb、呕吐毒素320ppb、T-2毒素160ppb、OTA16ppb的同位素内标混合标准品

2.3样品处理

称取5g样品各两份,加入同位素内标100uL,其中一份加入20mL84%乙腈水,另一份加入20mL50%甲醇水,超声波震荡提取20min,6000r/min离心5min,上清液过0.22um有机滤膜,液相色谱-串联质谱检测。

3.结果分析

3.1谱图

FB1、FB2、AFB1、OTA和T-2的外标及同位素内标的MRM图

DON和ZON的外标及同位素内标的MRM图

3.2回收率

项目

FB1

FB2

AFB1

ZON

DON

T-2

OTA

添加水平

600ng/g

600ng/g

20ng/g

400ng/g

800ng/g

400ng/g

40ng/g

回收率

83.6%

80.4%

101.8%

109.8%

88.0%

91.3%

86.9%



3.3线性

项目

相关系数

线性范围/ng

线性方程

FB1

0.9991

0.19-100

y = 219.68x - 1206.9

FB2

0.9996

0.19-100

y = 911.45x - 1989.7

AFB1

0.9993

0.049-40

y = 61482x + 6.8125

ZON

0.9995

0.094-35

y = 8008.3x - 42517

DON

0.9999

2-450

y = 2755.5x - 796.14

T-2

0.9994

0.1-100

y = 110254x - 63112

OTA

0.9997

0.01-20

y = 1824.1x + 1.5954






3.4整体污染情况

对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总,所有样品均未检出赭曲霉毒素和T-2毒素。96份玉米中有2份玉米不含有这6类真菌毒素,10份玉米只含有1类真菌毒素,32份玉米含有2类真菌毒素,44份玉米含有3类真菌毒素,6份玉米含有4类真菌毒素。

污染情况占比图

图片5.png

3.5区域分布情况

依据94份样品分布区域进行划分,对6种真菌毒素进行分析汇总(汇总表见下),西北地区玉米受真菌毒素污染的种类最少,污染程度极低;华中地区、华北地区、西南地区和东北地区毒素污染情况较重;华东地区和华南地区玉米受真菌毒素污染的种类和程度最高。

毒素种类

华东

华南

华中

华北

西南

西北

东北

总计

0

0

0

0

0

0

2

0

2

1

2

0

0

1

1

5

1

10

2

6

2

6

7

4

1

6

32

3

13

5

6

9

5

2

4

44

4

1

3

0

0

2

0

0

6

5

0

0

0

0

0

0

0

0

6

0

0

0

0

0

0

0

0

总计

22

10

12

17

12

10

11

94







3.6超限情况

3.6.1

对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总,依据GB 13078-2017 饲料卫生标准*进行超限判断(表1),超限样品共计14份,其中9份样品一类真菌毒素超限,剩余5份样品两类真菌毒素超限。针对赭曲霉毒素和T-2毒素含量,所有样品均合格;此外,其余留的毒素超限情况如下:伏马毒素B1+B2、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的超限样品份数分别为:3份、2份、11份和3份,其对应的超限率分别为3.2%、2.1%、11.7%和3.2%。

表1 部分饲料原料中6类真菌毒素检测标准及*

项目

产品名称

检测标准

*

黄曲霉毒素B1

玉米加工产品、花生饼

NY/T 2071

≤50ug/kg

OTA

谷物及其加工产品

GB/T 30957

≤100ug/kg

玉米赤霉烯酮

玉米及其加工产品

NY/T 2071

≤0.5mg/kg

呕吐毒素

植物性饲料原料

GB/T 30956

≤5mg/kg

T-2毒素

植物性饲料原料

NY/T 2071

≤0.5mg/kg

伏马毒素B1+2

玉米及其加工产品

NY/T 1970

≤60mg/kg






3.6.2

对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总,依据GB 2761-2017 食品安全国家标准 食品中真菌毒素*进行超限判断(表2),超限样品共计46份,其中25份样品一类真菌毒素超限,剩余21份样品两类真菌毒素超限。针对赭曲霉毒素含量,所有样品均合格;此外,其余留的毒素超限情况如下:黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的超限样品份数分别为:4份、35份和28份,其对应的超限率分别为4.3%、37.2%和29.8%。

表2 部分食品中6类真菌毒素检测标准及*

项目

食品类别

检验方法

*

黄曲霉毒素B1

玉米、玉米面及玉米制品

GB 5009.22

20ug/kg

OTA

谷物及其制品

GB 5009.96

5.0ug/kg

玉米赤霉烯酮

玉米、玉米面(渣、片)

GB 5009.209

60ug/kg

呕吐毒素

玉米、玉米面(渣、片)

GB 5009.111

1000ug/kg




3.7 单类毒素分析

由于所有样品均未检出赭曲霉毒素和T-2毒素,故只对其余四类真菌毒素进行单独分析94份玉米中6类毒素污染情况对比图

图片6.png

3.7.1 伏马毒素B1+B2

对96份玉米的伏马毒素B1和B2检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为88份,占比93.6%,检测结果在0.0503mg/kg-89.1mg/kg,中位值为6.41mg/kg;整体污染水平为10.9mg/kg,阳性污染水平为11.6mg/kg。

3.7.2 黄曲霉毒素B1

对96份玉米的黄曲霉毒素B1检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为29份,占比30.9%,检测结果在2.20ug/kg-76.4ug/kg,中位值为4.58ug/kg;整体污染水平为3.48ug/kg,阳性污染水平为11.3ug/kg。

3.7.3 玉米赤霉烯酮

对96份玉米的玉米赤霉烯酮检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为56份,占比59.6%,检测结果在10.6mg/kg-3.95×103mg/kg,中位值为98.3mg/kg;整体污染水平为329mg/kg,阳性污染水平为552mg/kg。

3.7.4 呕吐毒素

对96份玉米的呕吐毒素检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为56份,占比59.6%,检测结果在0.1mg/kg-7.0mg/kg,中位值为1.0mg/kg;整体污染水平为0.8mg/kg,阳性污染水平为1.4mg/kg。

4讨论

目前,从技术角度讲,饲料中真菌毒素检测共涉及到6大类,检测标准4项,前处理方法不一,净化产品各异,对人员、操作、设备要求苛刻,给检测带来严峻的挑战;从污染根源分析,一种真菌可能产生多种毒素,一种原料会受到多种真菌感染,往往是单个饲料样品需要检测多种真菌毒素;从现实情况来看,饲料受真菌毒素污染情况较严重,且分布不均匀,需要加强其毒素监测。本文所述的一步法检测,采用直提的方式,同位素校正的手段,在保证结果准确的前提下,很大程度上降低操作难度,缩短检测周期,同时也控制了实验成本。

综上,本文不仅为饲料中6类真菌毒素的检测提供有效的方法支撑,同时也为饲料中真菌毒素残留的检测方向提供指导,为保证饲料产品的质量提供帮助。


[1]王艳霞 饲料及原料中真菌毒素的危害、降解和检测技术研究[J].饲料研究,NO.08 2022:158.

[2]孙梅峰,豆小文,张磊,等.真菌毒素毒性及其在生物样本中检测技术研 究进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2020,34(10):788-800.

[3]张徽,孙金旺,刘媛,等.农产品真菌毒素污染生物控制关键技术创新与 综述 NO.08 2022 160 饲料研究 FEED RESEARCH 应用[J].中国科技成果,2020(3):69-70









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