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液相色谱法检测牛奶,奶粉等产品中黄曲霉毒素M1操作规程

发布时间: 2019-03-27  点击次数: 943次

1. 仪器

液相色谱仪配荧光检测器,震荡器(或高速搅拌器),高速离心机

 

2. 试剂与试液

色谱甲醇,蒸馏水,乙腈+水(25+75),石油醚,2.5 10%乙腈, 氢氧化钠溶液(0.5mol/L),玻璃纤维滤纸(PriboFast免疫亲和柱免费赠送)

 

3. 测定法

本法系用液相色谱法(GB/T 18980-2003)测定牛奶,奶粉等产品中的黄曲霉毒素M1,除另有规定外,按下列方法测定。

3.1 色谱条件

色谱柱:C18柱,150×4.6mm,5um

检测器:荧光检测器;激发波长365nm,发射波长435nm;

流动相:乙腈-水(25:75)

流  速:1.0ml/min

进样量:20ul

柱  温:室温

3.2  标准品溶液的配制

取黄曲霉毒素M1标准品,用乙腈稀释成0.5ug/ml的标准储备液。根据使用需要,准确吸取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl的黄曲霉毒素标准储备液,置5ml的容量瓶中,用流动相稀释至刻度,配成相当于1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液,即得。

3.3  样品前处理

3.3.1牛奶

将100mL牛奶水浴加热至40℃;

4000r/min离心15min,收集50mL清澈液待用;

3.3.2乳粉和粉状婴幼儿配方食品

称取10g奶粉样品,将100mL50℃水多次少量加入,搅拌,使奶粉充分溶解;

6000r/min离心15min,收集50mL清澈液待用;

3.3.3发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)

称取60 g混匀的试样,用0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液在酸度计指示下调pH至7.4;

用高速均质器在 9500 转/分钟,高速匀浆5 min

水浴加热至40℃;

4000r/min离心15min,收集50mL清澈液待用

3.3.4干酪

称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g置于50 mL离心管中,加2 mL水和30 mL甲醇;

用高速均质器在 9500r/分钟,高速匀浆5 min;

超声提取30 min;

在6000r/分钟下离心15 min,收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。

在分液漏斗中加入30 mL石油醚,振摇2 min;

待分层后,将下层移于50 mL烧杯中,弃去石油醚层。

重复用石油醚提取2次;。

将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中,减压浓缩至约2 mL;

浓缩液倒入离心管中,烧瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗涤,洗涤液一并倒入50 mL离心管中;

加水稀释至约50 mL,在6000 转/分钟下离心 5 min,上清液供净化处理。

3.3.5奶油

称取5g试样,置于50 mL烧杯中;

用20 mL石油醚将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。

加20 mL水和30 mL甲醇,振荡30 min后,将全部液体移于分液漏斗中;

待分层后,将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中,在旋转蒸发仪中减压浓缩至约5 mL,加水稀释至约50mL,供净化处理。

3.4  供试品溶液的制备

3.4.1 PriboFast® 黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的操作

将免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。准确移取50.0mL净化溶液注入玻璃注射器;

将空气压力泵与注射器连接,调节压力使溶液以约2-3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱,直至2~3mL空气通过柱体;

更换10ml注射器与亲和柱连接,在注射器中加入10ml水,调节压力使水以约6mL/min流速清洗亲和柱。

准确加入4mL色谱级乙腈洗脱,流速为1 mL/min~2mL/min,收集全部洗脱液于玻璃试管中,供检测用。(建议将乙腈的量分2-4次加入。每次加入后,要让甲醇充分浸泡柱子里的凝胶2分钟。洗脱后的乙腈溶液,建议水浴30℃加热吹近干。用10%乙腈定容后上液相)

3.5 测定

精密量取1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液各20ul,注入液相色谱仪,测定峰面积,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。另精密量取供试品溶液20ul,注入液相色谱仪,测定峰面积,从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素M1的量,计算,即得。

 

1.本实验应有相应的安全、防护措施,并不得污染环境。

2.残留有黄曲霉毒素M1的废液或废渣的玻璃器皿,应置于贮存容器(装有10%氯酸钠溶液)内,浸泡24小时以上,再用清水将玻璃器皿冲洗干净。

 

 

 

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